F质粒和R质粒的区别

质粒是细胞内的一种小型环状DNA分子，常用作DNA重组的载体。在分子生物学实验中，研究者通常会将目的基因插入质粒的多克隆位点，构建出新的重组质粒，使目的基因能够随着质粒载体进入受体细胞。高质量的质粒对于后续实验的成功至关重要。

对于刚刚进入实验室的新手来说，第一个熟悉的实验往往是质粒提取。跟兄师姐的步骤，记录每一个细节，但后来发现，大多数时候只是在手动重复提取过程，而没有真正理解其原理。接下来的日子，便是进行转化、涂板、挑选单克隆、摇菌、再次提取质粒等一系列操作。多么希望有一个自动化质粒提取机器人，能够省时省力。

让我们回顾一下质粒提取的过程。这一过程主要包括三个步骤：菌体扩繁、菌体裂解释放质粒DNA、质粒DNA的分离与纯化。其中，最常用的方法是碱裂解法，其特点是得率高、适用性广、快速、纯度高。

该方法的原理是在高pH值（pH12.0-12.6）和去污剂SDS的作用下，细胞壁并裂解细胞，使宿主细菌蛋白质变性。在此环境下，线性的DNA双螺旋结构会解开，但由于共价闭合质粒DNA分子量小且结构紧密，其互补链依然紧密结合在一起。当pH值恢复中性时，共价闭合的质粒DNA迅速准确地复性，而线性的染色体DNA则无法做到。通过离心，变性的染色体DNA与不稳定的大分子物质如RNA、蛋白质、破裂的细胞壁等相互缠绕形成大型复合物被去除。质粒DNA则通过乙醇沉积或硅胶膜吸附等方法被回收。

在提取过程中，可能会遇到各种问题。今天，我们来探讨一些常见的质粒提取问题及解决方案。

问题1：什么是影响质粒提取的关键因素？

答案：质粒提取的纯度和得率受到多种因素的影响，包括质粒本身的拷贝数和稳定性、宿主菌株的种类和培养条件、菌体的投入量、菌体裂解是否充分以及试验者的操作熟练度等。

问题2：质粒的拷贝数是如何决定的？

答案：根据复制特性，质粒可分为严紧型和松弛型两类。严紧型质粒在宿主细胞中仅含有1-2个拷贝，其复制与宿主细胞染色体受相同要素控制，在一定的细胞周期内进行复制。而松弛型质粒在宿主细胞中的拷贝数较多，可随时进行复制。质粒的恒定拷贝数与质粒复制控制系统、宿主细胞的遗传背景及生长条件有关。

问题3：为什么无法提取出质粒或质粒提取量很少？

答案：可能的原因包括菌体中无质粒、菌种老化、质粒拷贝数低以及裂解不充分等。对于某些质粒，在某些菌种中可能无法稳定存在，经过多次摇菌后可能导致质粒丢失。如果选用的是甘油保种菌，建议重新活化并挑选单菌落进行菌体扩繁。某些质粒属于中低拷贝质粒，也会导致提取量低。在质粒提取过程中，菌体量并非越多越好，过多的菌液投入可能导致裂解不充分。操作过于剧烈也可能导致基因组污染。

问题4：在质粒提取时，如何避免基因组污染？

答案：基因组污染通常是因为操作过于剧烈导致的。在质粒提取过程中，动作应尽量温和，避免选用过于剧烈的操作方法。

问题5：为什么有些质粒在纯化后长时间放置会降解？

答案：主要原因可能是核酸酶污染。除了可能在提取时引入外源核酸酶外，宿主菌的影响也不可忽视。如果宿主菌是end A+，含有大量的核酸酶，容易降解质粒DNA。如果制备的质粒需要长时间保存，建议更换为endA-宿主菌。

问题6：之前测序没问题的菌液，37℃扩大培养后，为什么质粒序列会出现异常？

答案：这种情况可能出现在大质粒或特殊序列中。原因可能是质粒在大肠杆菌中复制时发生了重组。可以将宿主菌更换为重组酶缺失的菌株，使质粒复制更加稳定。

问题7：电泳检测质粒DNA条带是什么样的？

答案：电泳检测时，环形双链的质粒DNA分子具有三种构型：共价闭合环形DNA（cccDNA）、开环DNA（ocDNA）和线性DNA（IDNA）。如果提取的质粒污染严重，电泳图上还可能显示宿主细胞的基因组和RNA污染。

如果大家对质粒提取还有任何问题或见解，欢迎在评论区留言讨论。